| 犬的精液冷冻技术 |
| 来自：中国工作犬业杂志社 时间：2006-10-29 |
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国外早在1957年就开展了犬冷冻精液的研究，Seager（l967）使用 Tris—柠檬酸—葡萄糖— 卵黄稀释液，获得80. 8％的受胎率，窝产仔数平均3．9头，前后共获得500头仔犬。为适应我国军、警犬及生物医学的发展需要，我们从1980年起开始进行犬的人工授精技术研究。目前已取得了采精、制冻和输精等研究的初步结果。现报告如下：
材料与方法
一、采精
犬精讹采自南京某研究所从西德和日本引进的德国牧羊犬，以手握法和手握结合假阴道法采集精液。采精时取其浓调部分，原精活力达70％以上，浓度为1亿/毫升以上，PH值为6～7，色味正常为合格。
二、稀释液
配方：I、三羟甲基氨基甲烷2、422克、果糖1．0克、柠檬酸1.36克、甘油8％、卵黄20毫升、加双蒸水至100毫升，青霉素1000单位/毫升、链霉素500微克／毫升。II、三羟甲基氨基甲烷4. 43克、果糖1．0克、柠檬酸2.49克、甘油5毫升、卵黄15毫升、双蒸水80毫4升，青霉素同I。III、乳糖11.0克、甘油4毫升、卵黄20毫升、双蒸水16毫升，青链霉素同I。
采获的精液在同温下按 1:1～2稀释（精液：稀释液），等量分装于100毫升容量的三角瓶中，并用纸片封口，包上8层纱布放在3～5℃的冰箱内降温，平衡1小时后立即冷冻。
三、制冻
用干冰和液氮做冷源，分别制成颗粒和安瓶两种剂型后，于液氮中贮存。
四、解冻
颗粒和安瓶两种剂型，均采用干解冻方法：
颗粒精液的解冻：将1～2粒冻精放入经干燥灭菌的试管内，在5O～55℃水浴中不断摇晃，至融化后取出。
安瓶精液的解冻：将安瓶中残留液氮倒去，直接在50～55℃水裕中不断摇晃，至冻精全部融化后取出。
两种剂型解冻后的冻精均立即放入38℃左右的保温箱中，镜检其活力，活力在0.3级以上用于输精。
五、输精
1、采用猪的光滑橡胶输精管作为犬用输精器。
2、发情的母犬用公犬试情，接受交配者当日进行首次输精，隔日再进行一次输精。如前两次输精进行得不太顺利，则再补输一次。
3、每次输入的有效精子数要求在3亿以上，输入总容量15～20毫升。
试验结果
一、不同稀释液成分的冷冻效果
三种稀释液配方的冻后活力和复苏率，配方I比配方II、III都好，（P<0.05）。配方II和配方III之间无明显差异（P>0.05）。
二、不同分装方法冻结效果的观察
六种不同的初冻温度（－2O—-150℃）之间，解冻后活力和总存活时间无显著差异（P>0.05）、而精子的顶体完整率以-80℃为最高；-80℃时的顶体完整率与-20℃、-40℃、－60℃比较差异极显著（P<0. 01），与-120℃，-15O℃比较差异不显著（P>0.05）。
四、不同冷源（干冰与液氮）制冻效果的比较
以液氮为冷源和以干冰为冷源，对犬精液进行制冻，两者间无显著差异（P>0. 05）。
五、冻精输精效果观察
冻精品质和输精技术的好坏，最终要看受胎率的高低。在本试验中，用冻精对9头正常母犬进行阴道内输精，结果2头怀孕（22％），平均每窝产仔2头。
小结与讨论
一、关于冻精剂型和冻结温度的问题
颗粒和安瓶这两种不同剂型对冻后活力、复苏率并未造成明显影响，皆可作为犬冻精剂型，但因犬的一次输精量较大，约10～15毫升，故从生产使用方便上看，安瓶剂型优于颗粒。犬精液冷冻以-80为宜。
二、关于输精技术问题
据国外资料报道，犬的冻精受胎率已达80％以上，窝产仔数平均3.9头。而本试验的受胎率仅为22％，窝产仔数也只有2头，均比国外低。经分析，其主要原因在输精技术上。在犬的自然交配过程中，犬的阴茎海绵体充塞阴道，公犬阴茎根部的球状海绵体膨大，使公母犬尾对尾地“锁结”在一起。每次交配一般持续10－20分钟，使射出精液流向子宫颈进入子宫，避免精液倒流。而本试验单一使用猪的输精器，作阴道内输精，难以控制冻精倒流，以致造成有效精子数不足。Simth和Graham（1984)曾报道在母犬Reagle发情期开始后的第一天和第三天，通过外科手术输入冻精，结果在子宫颈内输液（15亿精子）的7头母犬有4头怀孕，窝产数2-7头，而阴道内输精的7头母犬只有1头怀孕，并只产1仔犬。显然，输精部位与犬的受胎率和窝产仔数有很大关系。
另外，由于冻精在母犬生殖道内的存活时间缩短，本试验中是在母犬接受交配当天开始输精，故输精似乎早了些，应该适当推迟输精时间或增加输精次数。
三、冻精品质的问题
本试验受胎率低和窝产仔数少与冻精的品质也有一定关系，虽然每次输入的有效精子数约有3亿，实际上达到受精部位具有受能力的精子可能较少，从而影响了受胎率和窝产仔数。Bowen和Olar曾用鲜精（5毫升中平均含1.6亿个活精子）分别通过子宫颈对12头发情母犬每48小时输精一次。结果输鲜精的12头中有6头怀孕（50％）；输冻精的12头犬中有3头怀孕（25％）。这表明输入的有效精子数与母犬受胎率有关。因此要提高受胎率和窝产仔数，必须提高冻精品质。(公安部南京警犬研究所 潘寿文 刘湖)
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